[ЗВУК] [ЗВУК] Здравствуйте!

Меня зовут Вениамин, и я буду читать часть лекций в этом курсе.

Сегодня мы поговорим о том,

как создавать конструкции для получения трансгенных организмов.

Вы уже знаете, что большинство, если не все элементы,

из которых состоят такие конструкции, позаимствованы биологами у природы,

то есть они содержатся в геномах тех или иных живых организмов.

Но в то же время вы знаете, что именно в той комбинации, в которой нам нужно,

элементы конструкции для получения трансгенного организма ни в каком из живых

организмов не представлены.

Как же нам быть?

Нам нужно научиться, значит, извлекать эти необходимые элементы из геномов

живых организмов и комбинировать их друг с другом.

Вот об этом мы будем говорить в течение нескольких лекций,

а сегодня поговорим именно о том,

как извлечь какую-то последовательность ДНК из генома организмов.

Сначал вспомним школьную программу о том, что же, вообще, такое ДНК.

Ну, ДНК — это химическая молекула,

основными строительными блоками которой являются химические вещества нуклеотиды.

Их бывает четыре типа, мы будем называть их буквами, и мы будем говорить,

что есть четыре буквы: А, Т, Г и Ц.

ДНК — это двухцепочечная молекула,

то есть одна длинная молекула ДНК состоит из двух цепей, и буквы,

которые составляют каждую из этих цепей, располагаются в них неслучайным образом.

Если в одной цепи находится буква А, то в другой цепи обязательно находится буква Т,

если в одной цепи буква Г, то в другой буква Ц.

Это называется правило комплементарности,

как будто буквы комплименты друг другу делают.

А всегда делает комплименты Т, а Г всегда делает комплименты Ц.

При этом А никогда не может стоять напротив Ц.

Это обусловлено химической природой самих веществ, которые, собственно,

и являются вот этими буквами, азотистых оснований.

Затем нужно сказать, что комплементарные участки ДНК комплементарны,

то есть вот именно такие, у которых нужные буквы — А напротив Т, Т напротив А,

Г напротив Ц, Ц напротив Г — они стремятся связаться друг с другом,

то есть они не просто вот так случилось, что они стоят друг напротив друга.

Как только у них появляется такая возможность, это для них именно

очень хорошо и очень выгодно соединиться друг с другом в двухцепочечную молекулу.

Теперь, когда мы вспомнили, что такое ДНК, поговорим о том,

как же извлечь какой-то фрагмент из этой молекулы.

На самом деле, я тут немножко слукавил.

Мы не то чтобы извлекаем какие-то фрагменты, мы просто берем исходную

геномную ДНК в очень небольшом количестве, а затем копируем какой-то нужный нам

элемент, какой-то нужный нам участок очень-очень-очень много раз,

так много раз, что в конечном счете у нас получается совсем-совсем чуть-чуть

исходные длинные молекулы, геномные ДНК, и огромное количество нужного нам фрагмента,

так что в сумме можно даже пренебречь исходной длинной молекулой.

Как же это делать?

Ключевую роль в этом процессе копирования,

которая называется полимеразной цепной реакцией, или ПЦР, играет фермент.

Ферменты, это вы помните, такие биологической природы катализаторы,

и фермент, который копирует ДНК, называется ДНК-полимераза.

Работает она в специальном буфере, который содержит определенные соли,

без них фермент неактивен.

И она строит новую молекулу ДНК из букв, вот этих самых букв — А, Т, Г, Ц.

То, какой же именно участок будет строить фермент ДНК-полимераза,

определяет праймер.

Праймер — это короткий одноцепочечный фрагмент ДНК.

То есть, обратите внимание, до этого все фрагменты, о которых мы говорили,

были двухцепочечными, а это одноцепочечный фрагмент,

который комплементарен началу или концу участка ДНК, который мы хотим скопировать.

Комплементарен — то есть содержит те самые нужные буквы: напротив А Т,

напротив Т — А.

Если комплементарен участку ТТТ, значит, содержит буквы ААА.

Еще одна особенность праймера заключается в том, что его концы,

начало и конец, неодинаковые.

Только с одним из концов может связаться ДНК-полимераза.

На рисунке этот конец обозначен стрелочкой.

И, собственно, то, с каким концом праймера связывается ДНК-полимераза,

определяет то, в каком направлении она будет двигаться, синтезируя новую цепь.

На самом деле, для того чтобы ДНК-полимераза начала синтез,

ей недостаточно только праймера.

Ей нужен короткий двухцепочечный участок,

образованный одной из цепей матрицы и праймером.

Для того чтобы праймер соединился с одной из цепей матрицы, он,

естественно, должен быть этому участку цепи комплементарным.

Таким образом, конец праймера определяет, в каком направлении будет идти синтез,

а то, из каких букв состоит праймер, определяет,

в каком месте он свяжется с ДНК-матрицей,

потому что он может связаться только с комплементарным участком.

Вы помните, что некомплементарные буквы друг с другом взаимодействовать не хотят.

Итак, теперь, когда мы разобрали все необходимые теоретические моменты,

давайте обсудим, как, собственно, проходит полимеразная цепная реакция.

Мы смешиваем в пробирке несколько компонент, а именно: матрицу для синтеза,

то есть длинную геномную ДНК, двухцепочечную; буфер; буквы,

А, Т, Г, Ц, или нуклеотиды по-другому; праймеры — это

одноцепочечные короткие фрагменты, которые комплементарны началу фрагмента,

который мы хотим получить, и концу фрагмента, который мы хотим получить,

то есть у нас должно быть два праймера — один для начала фрагмента,

другой — для конца фрагмента; и ДНК-полимеразу.

Ну, казалось бы, чтобы начался синтез,

у нас праймеры должны связаться с одной из цепей ДНК хотя бы.

Ну, каждый праймер со своей цепью.

Но этого не происходит, потому что ДНК уже двухцепочечная молекула,

и в ней цепи уже комплементарны друг другу.

Им хорошо вместе, и третий здесь лишний.

Для того чтобы разлучить цепи ДНК друг с другом, вы помните,

что для них это, вообще-то,

энергетически выгодно вместе находиться, нам нужно нашу реакцию нагреть.

Мы нагреваем реакцию до температуры примерно 95–98 градусов,

и при такой температуре цепи ДНК расходятся, отходят друг от друга.

На самом деле праймеры все еще не могут связаться при этом с той или иной цепью

ДНК, потому что температура реакции слишком высокая.

Да, цепи теперь стремятся с кем-то связаться,

но мы же подняли температуру и только что поговорили о том, что это приводит к тому,

что связи между цепями ДНК при этом рушатся.

Поэтому для того чтобы праймеры смогли, наконец, воссоединиться с комплементарными

им участками матрицы, то есть геномной ДНК, необходимо температуру опустить.

Мы опускаем температуру примерно до 60 градусов, это зависит от, на самом деле,

конкретных праймеров и матрицы, ну, будем считать,

около 60 градусов где-то в среднем.

И при такой температуре вы видите, что праймеры связываются с

соответствующими цепями ДНК, причем обратите внимание,

именно в комплементарных участках и именно в конце и в начале нашего фрагмента,

то есть на самом деле мы сделали праймеры так, чтобы ДНК-полимераза,

когда вот она сейчас связалась с нашим комплексом праймера и матрицы,

она от начала нашего фрагмента двигалась вправо,

а от конца нашего фрагмента двигалась влево.

Но для того чтобы вообще синтез начался,

и ДНК-полимераза начала синтезировать новые последовательности ДНК,

необходимо обеспечить комфортную для ее работы температуру,

для разных ДНК-полимераз эта температура разная, обычно это около 72 градусов.

Поэтому мы еще поднимаем температуру до 72 градусов.

Теперь процесс пошел.

ДНК-полимераза синтезирует одну цепь ДНК и включает в нее буквы, комплементарные

матрице, то есть опять же напротив Т ставит А, напротив Г ставит Ц и так далее.

И ДНК-полимераза так двигается,

как вы можете здесь увидеть на этой схеме, синтезируя новую цепь какое-то время.

На самом деле, какое время, определяется двумя параметрами.

Во-первых, ДНК-полимераза просто не может двигаться вечно,

и включив определенное количество букв в растущую цепь,

— обычно это несколько тысяч, не больше, — она устает и отваливается.

Но на самом деле можно контролировать, как долго будет идти синтез ДНК, еще и изменяя

температуру в реакции после какого-то определенного промежутка времени.

То есть, например, если мы снова нагреем реакцию до 98 или 95 градусов,

то ДНК-полимераза отвалится от ДНК в тот момент, когда мы это сделаем.

Таким образом, длина продукта определяется временем,

которое ДНК-полимераза синтезирует новую цепь.

Итак, как я уже сказал, мы,

после того как ДНК-полимераза какое-то время включала буквы в новую цепь,

поднимаем температуру снова, и у нас возвращается все к исходной ситуации,

когда цепи разделились друг с другом, но только теперь цепей у нас стало больше.

Кроме имевшейся в реакции матрицы еще есть две новые синтезированные цепи.

И теперь мы повторяем все сначала.

Мы опускаем температуру до 60 градусов,

и вы видите, как с исходными молекулами матрицы,

так и с вновь синтезированными молекулами могут связаться снова праймеры.

Это и происходит.

И мы снова поднимаем температуру до 72 градусов,

и у нас снова происходит синтез молекул при помощи ДНК-полимеразы.

Мы повторяем такой цикл: 98 — 60 — 72 еще раз,

и еще раз, и еще раз.

Посмотрите на изображение.

Посмотрите на видео, что происходит.

У нас образуется все больше и больше цепей,

причем большинство из этих цепей цепей.

Это как раз те фрагменты, которые мы хотели бы получить,

то есть короткие фрагменты,

ограниченные одним нашим праймером в начале и другим наши праймером — в конце.

Ну, вы помните, что праймеры мы подбирали таким образом,

чтобы у нас один из них именно соответствовал началу необходимого нам

фрагмента и второй соответствовал концу необходимого нам фрагмента.

То есть то, что мы получаем в конце, в большей степени,

по большинству — это именно те...

тот фрагмент, который мы хотели бы наработать,

тот участок исходной матричной ДНК, которую мы хотели бы наработать.

Есть и другие фрагменты, вы видите.

Это как исходная матрица, так и более длинные фрагменты, которые только с одной

стороны содержат наш праймер, а со второй стороны закончились тем,

что просто ДНК-полимераза отвалилась по какой-то причине от матрицы,

или из-за того, что температура поднялась, или из-за того,

что она просто устала (как мы это называем, да?) синтезировать новую ДНК.

Но таких длинных молекул намного меньше, чем нужных нам коротких.

Можно посчитать, что через 35 циклов у нас коротких молекул будет примерно

17 миллиардов, а длинных молекул, которые содержат праймер на одном конце,

около 35 копий, а молекул исходной матрицы — всего одна копия,

что на самом деле по сравнению с 17 миллиардами — совершенно мизерное

количество, которым можно спокойно пренебречь, и считать, что на выходе у нас

получились только нужные нам целевые вот эти вот короткие участки.

Ну, собственно, вот таким образом, при помощи полимеразной цепной реакции

можно практически любой участок исходной ДНК наработать в таком количестве,

что дальше забыть просто про исходную ДНК и все остальные примеси в этой реакции.

На самом деле ПЦР — не такой абсолютно приемлемый во всех ситуациях метод,

как может показаться на первый взгляд.

У него есть ряд ограничений.

Первое важное ограничение — это специфичность праймеров.

На самом деле молекулы исходной геномной ДНК очень длинные,

и очень часто так случается, что то,

что является началом нашего искомого фрагмента, элемента,

та последовательность, которую мы хотели бы включить в праймер или комплиментарная

ей последовательность, встречается в геноме не один раз, а несколько.

И тогда, когда мы подбираем праймеры, может оказаться,

что они случайным образом свяжутся не с нужной нам последовательностью,

а с какой-то другой, и на выходе наш ПЦР-продукт, то есть то,

что мы получим в результате ПЦР-реакции будет совсем не тем, что мы хотим.

Вторая проблема — это длина продукта.

Как я сказал, даже если мы будем очень долго поддерживать температуру,

комфортную для ДНК-полимеразы, то есть при которой она может синтезировать,

она все равно через максимум несколько тысяч букв, нуклеотидов,

отвалится от ДНК и прекратит синтез.

Этим лимитирован максимальный размер ПЦР-продукта,

который может вообще образоваться в реакции.

Для большинства случаев это несколько тысяч нуклеотидов, ну,

в некоторых случаях, используя специальные ДНК-полимеразы,

можно получить продукты большие, несколько большие, чем 10000 букв или нуклеотидов.

Ну, существенно больше, чем вот этот предел в 10000, поднять эффективность

реакции уже нельзя, то есть сделать существенно больше продукта нельзя.

Ну, тем не менее, эти проблемы можно решить с помощью других методов,

о некоторых из них мы будем говорить буквально в следующей лекции.

Зато у метода ПЦР есть много преимуществ.

Одно из них, которое мы сейчас обсудим,

совершенно замечательное и оно связано с тем, что на самом деле я сказал,

что праймер должен быть комплиментарен матрице.

Но это не совсем так.

Комплиментарен должен быть только небольшой участок праймера,

который находится вот именно на том конце, где будет связывание с ДНК-полимеразой,

где у нас была стрелочка нарисована.

На другом конце праймера можно добавлять нуклеотиды или буквы,

которые не комплиментарны матрице.

А поскольку все наши получаемые фрагменты, вот эти короткие фрагменты,

которые нам нужны, они содержат праймеры на своих концах, то получается,

что все наши фрагменты на концах могут содержать какие-то последовательности,

которые, вообще говоря, исходно в матрице не присутствовали.

И это очень удобно и полезно для последующих методов,

о которых мы поговорим в следующей лекции.

2.1. Ctrl+C для ДНК: полимеразная цепная реакция

ГМО: технологии создания и применение

与讲师见面