Существует множество инфекционных заболеваний, причины которых долгие годы казались необъяснимыми. Только в последние десятилетия стало понятно: более 70% из них вызваны вирусами. Причина большинства случаев рака печени — вирусы гепатитов В и С, рака шейки матки – папилломавирусы, более половины случаев диабета 2-го типа обусловлено последствиями заражения вирусом краснухи и другими вирусами. Вирусы — это то, что касается каждого из нас. В нашем курсе вы узнаете о том, как устроены вирусы, чем они отличаются от живых организмов и какие механизмы используют для того, чтобы поразить клетки человека. Это поможет вам понять, как работают противовирусные препараты и вакцины. ОРВИ, кишечные инфекции, гепатиты, корь, краснуха, бешенство, СПИД — вот далеко не полный список заболеваний, которые имеют вирусную природу. Разобраться в многообразии вирусов вам помогут учёные, которые каждый день работают с ними в лабораториях. Они расскажут об актуальных проблемах и задачах современной вирусологии, которые у всех на слуху. Например, о том, зачем исследователи воссоздали вирус гриппа «испанки», унёсший в начале прошлого века десятки миллионов человеческих жизней, а также о том, что такое вирус Эбола, и почему он опасен. Вы побываете в современной вирусологической лаборатории и увидите, как нужно работать с вирусами, чтобы исключить вероятность заражения персонала и выхода вируса за пределы лаборатории. И конечно же, вы узнаете, как можно использовать вирусы на благо человека.
Методы диагностики вирусных инфекций
Loading...
来自 Novosibirsk State University 的课程
Основы вирусологии (Introduction to Virology)
181 个评分
从本节课中
Введение в вирусологию
В этом модуле вас ждёт знакомство с миром вирусов. Вы познакомитесь с основными понятиями, которыми пользуются ученые для описания вирусных частиц, с принципами классификации вирусов, а также с тем, как развивается противовирусный иммунный ответ, и какие существуют методы диагностики вирусных инфекций. Кроме того, чтобы вам было легче ориентироваться в описании жизненного цикла вирусов, мы вспомним основные молекулярно-биологические процессы, которые происходят в клетках.
与讲师见面
Сергей НетесовПроректор НГУ, чл.-корр. РАН, д-р биол. наук, профессор
Заведующий лабораторией бионанотехнологий НГУ
Маргарита РоманенкоКандидат биологических наук
Научный сотрудник лаборатории бионанотехнологий НГУ
Артем ТикуновКандидат биологических наук
Факультет естественных наук НГУ
Галина КочневаДоктор биологических наук
Зав. лабораторией ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор"
[ЗАСТАВКА]
[ЗАСТАВКА]
[ЗАСТАВКА] Сегодня
мы поговорим о методах диагностики вирусных инфекций.
Для постановки диагноза могут использоваться методики как выявления
непосредственно самого вируса, так и антител к нему.
В первом случае можно анализировать как присутствие нуклеиновых кислот,
так и белков.
Это всё прямые методы,
при которых непосредственно анализируется клинический материал.
Они являются наиболее быстрыми.
Однако в некоторых случаях потребуются так называемые непрямые методы,
то есть наработка вируса в больших количествах и уже дальнейший его анализ.
Каким бы методом мы ни пользовались,
очень важно правильно собрать клинический материал для анализа.
А особенно важно, в какой момент времени берется этот анализ,
зачастую он должен быть взят в начале заболевания, когда возбудитель еще
в большом количестве выделяется, а также не связан пока еще антителами.
Также исходя из того, какое заболевание мы предполагаем, необходимо взять
определенный материал, в котором концентрация вируса будет максимальной.
Не последнюю роль в успешной диагностике играет среда,
в которой берется материал, а также как материал транспортируется и как хранится.
И неправильный первый этап может повлечь за собой и неправильную дальнейшую
диагностику.
Это стоит иметь в виду.
Большое количество методов диагностики основано на специфическом
взаимодействии антител с антигенами.
Такие методы называются серологическими.
И такими методами можно выявлять как сами антигены, то есть вирусы, так и антитела.
Если мы ищем у пациента определенные антигены,
тогда мы будем использовать определенные искусственно синтезированные антитела.
И наоборот, если мы пытаемся выявить антитела,
мы будем использовать определенные искусственные антигены.
И первый из таких серологических методов, которые мы рассмотрим,
это реакция иммунофлюоресценции, или сокращенно РИФ.
Он применяется для выявления определенных вирусных антигенов.
Он основан на использовании антител, меченных красителями.
Такие антитела получают из специальных клеток, которые выращиваются
в искусственных условиях, после чего эти антитела уже метятся красителем.
Если в пробе, полученной от больного, содержится определенный антиген,
который мы пытаемся детектировать, то они свяжутся с меченными антителами,
и мы увидим под микроскопом специфическую окраску,
которая нам будет говорить о том, что эта проба положительная.
Но РИФ — это все-таки качественный метод, а в ряде случаев нужна обязательно и
количественная оценка — сколько же этого антигена находится в пробе.
Поэтому сейчас наиболее широко распространен другой метод,
который называется иммуноферментный анализ, или сокращенно ИФА.
Он по своей сути сходен с РИФ,
но основывается на мечении антител не определенными красителями,
а ферментами, которые превращают бесцветный субстрат в окрашенный продукт.
Это позволяет стандартизовать метод, а также использовать его не
только в качественном варианте, но и в количественном.
И этим методом можно выявлять как антигены, так и антитела.
В случае, если мы выявляем определенный антиген, тогда в планшете ко дну лунок
будут прикреплены искусственно полученные антитела к этому вирусу.
В лунки закапываются образцы, полученные от пациентов.
И если в этом образце есть вирус, он соединится с антителом.
Затем добавляют вторичные антитела к этому вирусу, которые уже соединены с ферментом.
После этого отмывают все несвязавшиеся вторичные антитела и антигены.
И после этого добавляют бесцветный субстрат.
Там, где есть антиген и соответственно связанное с ним вторичное антитело с
ферментом, произойдет окрашивание,
то есть бесцветный субстрат под действием фермента превратится в окрашенный продукт.
После этого реакцию останавливают и на специальном приборе оценивают
интенсивность свечения этого окрашенного продукта, на основании
чего делают вывод о том, сколько же антигена содержится в той или иной пробе.
А теперь давайте посмотрим, как проводят иммуноферментный анализ в лаборатории.
Сначала в две лунки планшета, ко дну которого прикреплены антитела,
добавляют отрицательные контрольные образцы.
Затем добавляют положительные.
В нашем случае их два.
Затем добавляют пробы, полученные от пациентов.
[БЕЗ ЗВУКА]
После этого в
каждую лунку добавляют вторичные антитела, связанные с ферментом.
[БЕЗ ЗВУКА] Затем
планшет переносят в термошейкер,
где проходит одночасовая инкубация для связывания антигенов и антител.
[БЕЗ ЗВУКА] Далее
производят отмывку на специальном приборе от несвязавшихся антигенов и антител.
[БЕЗ ЗВУКА] После этого добавляют бесцветный субстрат.
[БЕЗ ЗВУКА] И в тех лунках,
где был антиген, и с ним связались вторичные антитела с ферментом,
произойдет превращение этого бесцветного субстрата в окрашенный продукт.
После этого реакцию останавливают, этот раствор изменяет pH среды,
и краситель меняет свой цвет с синего на желтый.
Далее производят подсчет интенсивности свечения красителя.
Результат выдается в виде таблицы.
По ней мы можем сказать, какие из образцов были отрицательные, а какие
положительными, и какова интенсивность свечения, то есть количества вируса.
А теперь рассмотрим еще один серологический метод.
Этот метод называется реакцией гемагглютинации.
Он основан на способности вирусов агглютинировать,
то есть связывать, эритроциты.
В норме не связанные эритроциты упадут на дно конической лунки
и образуют такую точку, которую у исследователей принято называть «пуговка».
Если же в пробе есть вирус, он свяжет эритроциты в сеточку, которая не
упадет на дно лунки, а образуется вот такой круг, так называемый «зонтик».
Так и проявляется реакция гемагглютинации.
Если же нам надо выявить антитела,
то мы будем использовать реакцию торможения гемагглютинации,
то есть мы добавим в каждую лунку вирус и эритроциты и закапаем различные пробы.
Там, где есть антитела, они свяжут вирус, и эритроциты упадут на дно.
Там где антител нет, вирус свяжет эритроциты, и получится «зонтик».
А теперь давайте перейдем к методам выявления непосредственно нуклеиновых
кислот.
А первое место среди этих методов занимает полимеразная цепная реакция,
или сокращенно ПЦР.
Суть метода заключается в том, чтобы обнаружить специфический
фрагмент ДНК или РНК вируса в биологическом материале.
В ходе полимеразной цепной реакции этот специфический фрагмент многократно
копируется, после чего его можно детектировать.
Стоит оговориться, что ПЦР можно проводить только с ДНК.
Поэтому у тех вирусов, у которых нуклеиновая кислота представлена РНК,
необходимо сначала поставить реакцию обратной транскрипции,
а затем уже ставить ПЦР.
Первым этапом при постановке полимеразной цепной реакции
является выделение нуклеиновых кислот.
Методов выделения существует очень много, мы сейчас рассмотрим один из них.
Вначале в каждую пробирку, в которой будет происходить выделение нуклеиновой кислоты,
добавляют внутренний контрольный образец.
Для того чтобы быть уверенными, что в процессе выделения,
а дальше при постановке реакции, не попали никакие ингибиторы,
которые дадут ложноотрицательный результат.
Далее добавляют пробы, полученные от пациентов, в нашем случае их четыре.
Далее добавляют отрицательный контрольный образец.
И затем положительный контрольный образец для корректной интерпретации результатов.
Далее добавляют лизирующий раствор, который разрушит оболочку вируса,
и нуклеиновая кислота высвободится в раствор.
Далее содержимое пробирок перемешивают и ставят в термошейкер.
Необходимо добавить, что лизирующий раствор содержит магнитные частицы,
которые облегчают визуализацию осадка при последующем осаждении нуклеиновых кислот.
Вот добавляют осадитель нуклеиновых кислот в каждую пробирку.
После этого снова содержимое пробирок
перемешивают на шейкере и центрифугируют 5
минут при 13 тысячах оборотах в минуту.
Пробирки достают по окончании центрифугирования и переносят в
магнитный штатив и удаляют надосадочную жидкость,
а осадок представляет собой нуклеиновые кислоты с магнитными частицами.
Далее осадок промывают, добавляют специальный промывочный раствор.
Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют.
Таких отмывок производят две.
После окончания второго центрифугирования производят
снова удаление надосадочной жидкости,
осадок высушивают на воздухе и добавляют элюирующий раствор.
При этом нуклеиновая кислота из осадка переходит в этот раствор.
Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в термошейкере,
после чего снова центрифугируют.
После этого центрифугирования в осадке остаются только магнитные частицы,
а нуклеиновая кислота оказывается в растворе.
Далее этот раствор используют для постановки полимеразной цепной реакции.
Если мы выделяли РНК, то сначала производят реакцию обратной транскрипции.
ПЦР проводят в специальном приборе,
который называется амплификатор или термоциклер.
Он поддерживает определенный температурный режим, необходимый для проведения ПЦР.
ПЦР-смесь содержит добавленную ДНК,
в которой есть интересующий нас фрагмент, праймеры, нуклеотиды и полимеразу.
На первой стадии температура повышается до 95 градусов, чтобы цепочки
ДНК разошлись друг относительно друга, и эта стадия называется денатурацией.
Затем температура понижается до 50—60 градусов,
при этом праймеры находят комплементарные участки и связываются с ними.
Эта стадия называется отжиг праймеров.
Стоит сказать, что праймеры специально синтезируются искусственно таким образом,
чтобы они ограничивали справа и слева интересующий нас фрагмент.
Затем температура повышается до 72 градусов, и это рабочая температура
для ДНК-полимеразы, и отталкиваясь от праймеров, она достраивает дочерние цепи.
Эта стадия синтеза.
Затем цикл повторяется: снова идет денатурация, отжиг праймеров и синтез.
Затем еще и еще, и так от 30 до 40 раз.
В итоге, через 40 циклов из одной молекулы ДНК мы получим 10 в
двенадцатой копии искомого фрагмента этой ДНК.
В нашем случае мы проводили ПЦР в режиме реального времени.
Это значит, что синтезированные копии фрагмента ДНК метились красителем.
Прибор регистрировал интенсивность свечения,
и по ходу реакции строился график накопления искомого фрагмента.
Здесь зеленым цветом отмечены графики накопления
фрагмента внутреннего контрольного образца.
Мы видим все 6 кривых, это значит,
что во всех шести случаях выделение ДНК было произведено корректно.
Красным цветом отмечены графики накопления фрагмента ДНК вируса гепатита С.
Жирным выделен положительный контрольный образец, и мы видим три графика.
Напомню, что у нас было четыре пробы, это значит,
что три из них оказались положительными, а одна отрицательной.
И вот в этой таблице мы видим эти результаты,
что отрицательным оказался второй образец.
И у первого, третьего и четвертого мы видим интенсивность свечения,
то есть то количество вируса, которое у нас было в пробе.
В заключение стоит упомянуть, что в отдельных случаях для диагностики вирусных
инфекций могут использовать диагностику с помощью электронного микроскопа,
то есть обнаруживать непосредственно вирус, и по форме вериона определяют,
какой же именно это вирус.
Таким образом, мы познакомились с методиками,
которые используют для диагностики вирусных инфекций.
А со следующего модуля вы начнете знакомиться с вирусами,
которые вызывают острые респираторные заболевания.
